本通则中介绍的灭菌方法可应用于药品制剂、原料药、辅料、医疗器械、药品包装材料及设备表面等物品的灭菌，以将残留存活微生物的概率降低至预期水平。

灭菌是指采用适当的物理或化学手段杀灭或去除物品中存活微生物的过程。无菌物品是指不含存活微生物的物品。然而，任何一批无菌物品的绝对无菌性均无法通过检测来保证或验证。一批物品的无菌状态只能以残留存活微生物的概率来表示，即非无菌单元概率（PNSU）或无菌保证水平（SAL）。灭菌物品所达到的PNSU可通过验证来确定。

无菌物品的无菌保证不能依赖于最终产品的无菌检验，而应依靠经过验证的灭菌工艺、严格的GMP管理以及贯穿整个生产过程的健全无菌保证体系。

无菌药品的生产包括终端灭菌工艺和无菌生产工艺。经终端灭菌工艺处理的物品，其PNSU不得超过10⁻⁶。灭菌工艺控制涵盖工艺开发、工艺验证和日常监控等阶段。

01 灭菌工艺的开发

灭菌工艺的开发应综合考虑待灭菌物品的性质、灭菌方法的有效性、灭菌后物品的完整性与稳定性，同时兼顾经济因素。在条件允许时，应优先选择终端灭菌工艺。若终端灭菌不适用于相关物品，则应采用无菌生产工艺以满足无菌保证要求。

综合考虑灭菌效果和对物品的影响，灭菌工艺可分为过度杀灭法、生物负载/生物指示剂法（又称残存概率法）和生物负载法。过度杀灭法通常适用于耐热物品。

物品的无菌保证与灭菌工艺和灭菌前的生物负载均密切相关。在灭菌工艺开发过程中，需对污染物品的微生物种类、数量和耐受性进行全面评估。

02 灭菌工艺的验证

灭菌工艺的验证是确保无菌性的前提条件。灭菌工艺只有经过验证后方可正式实施。验证包括：

① 制定验证方案并建立评价标准；

② 确认设备的设计与选型；

③ 确认灭菌设备文件完整、安装正确且运行正常；

④ 确认灭菌设备、关键控制系统和记录系统在规定参数范围内运行；

⑤ 使用实际物品或模拟物，按预定灭菌方案进行重复试验，确认关键工艺参数符合预定标准，并确认灭菌物品的无菌保证水平达到要求；

⑥ 汇总并定稿所有文件和记录，编制验证报告。

03 灭菌工艺的日常监控

在日常生产过程中，必须对灭菌工艺的运行进行监控，以确认关键参数（如温度、压力、时间、湿度、灭菌剂浓度和吸收辐射剂量）保持在已验证的范围内。同时，应持续评估灭菌工艺的有效性以及灭菌物品的安全性和稳定性。必须建立相应的变更和偏差控制程序，确保灭菌工艺始终处于受控状态。

灭菌工艺须进行定期再验证。当灭菌设备或程序发生变更时，包括待灭菌物品的装载方式或数量发生变化，均需进行再验证。

在验证和日常监控阶段，应根据风险评估结果对微生物种类、数量和耐受性进行监测。在整个生产过程中应采取降低生物负载的措施，确保其保持在规定限度内。

灭菌后，应防止灭菌物品被再次污染。容器及其密封系统必须保证在所有条件下的有效期内维持无菌状态。

04 灭菌方法

常见灭菌方法包括湿热灭菌、干热灭菌、辐射灭菌、气体灭菌、过滤除菌、气相灭菌和液相灭菌。根据待灭菌物品的特性，可选用一种或多种组合方法。

蒸汽灭菌法

该方法将物品置于灭菌设备中，利用饱和蒸汽、蒸汽-空气混合物、蒸汽-空气-水混合物或过热水使微生物细胞内的蛋白质和核酸变性，从而杀灭微生物。其灭菌能力强，是最有效且应用最广泛的热力灭菌方法。药品、容器、培养基、无菌服、橡胶塞及其他耐高温高湿的物品均可采用此方法灭菌。流通蒸汽通常不足以杀灭细菌芽孢，一般仅作为热敏无菌产品的辅助处理手段。

湿热灭菌工艺的开发必须考虑待灭菌物品的热稳定性、热穿透特性和生物负载等因素。湿热灭菌通常采用温度-时间参数或结合F₀值进行控制（F₀为标准灭菌时间，相当于121°C下达到的灭菌时间）。无论采用何种控制参数，均须证明灭菌工艺及监控措施在日常运行中能确保灭菌后PNSU ≤ 10⁻⁶。多孔性或刚性物品可通过与饱和蒸汽直接接触进行灭菌。灭菌过程中，灭菌室和物品内的空气和冷凝水必须彻底排除，以防止残留空气阻碍蒸汽接触所有暴露表面，从而破坏饱和蒸汽的温度-压力关系。对密封容器中的液体进行灭菌时，灭菌介质首先将热量传递至容器表面，再通过传导和对流作用对内部液体进行灭菌。如有必要，可采用空气过压来平衡容器内部与灭菌室之间的压差，防止容器密封完整性受损。

湿热灭菌时，物品的装载方式必须适当。装载方式的确认应考虑生产中的最大、最小和典型装载量及摆放方式，以确保灭菌效果和重现性。装载热分布试验应尽可能使用实际待灭菌物品。如使用替代物，应根据物品的热力学特性进行适当的风险评估。热穿透试验应在待灭菌物品的冷点处放置足够数量的温度探头。如有数据或证据表明将探头放置在外部能够充分反映热穿透情况，则可考虑在外部放置探头。

微生物挑战试验进一步确认灭菌效果。生物指示剂的放置位置应根据物品特性、装载热分布和热穿透试验结果来确定。应根据灭菌工艺选择适当的生物指示剂。嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）通常作为过度杀灭法的生物指示剂。对于热不稳定物品的灭菌，常使用梭菌芽孢、枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌。

采用生物负载/生物指示剂法和生物负载法的灭菌工艺，在整个日常生产过程中必须对物品的微生物污染进行持续、严格的监测。应采取各种措施降低微生物污染水平，尤其要防止耐热细菌的污染。

湿热灭菌的冷却阶段应采取措施防止灭菌物品被再次污染。

干热灭菌法

该方法将物品置于干热灭菌器或隧道式灭菌器等设备中，利用干热空气杀灭微生物或去除热原。适用于耐热但不适合湿热灭菌的物品，如玻璃器皿、金属容器、纤维制品、陶瓷制品、固体试剂和液体石蜡等。

干热灭菌工艺的开发必须考虑物品的热稳定性、热穿透效率和生物负载（或内毒素污染水平）等因素。灭菌条件通过温度-时间参数或结合F_H值确定（F_H值为标准灭菌时间，相当于160°C下达到的灭菌时间）。干热灭菌的典型温度范围为160–190°C。用于去除热原时，温度范围一般为170–400°C。无论采用何种灭菌条件，所有物品灭菌后的PNSU均须≤10⁻⁶。

装载方式验证应考虑待灭菌物品的最大和最小装载量及摆放方式。对于连续式干热灭菌设备，还应考虑传送带运行中不同位置的温度差异。应特别关注热穿透性较差的物品，以确保灭菌效果和重现性。由于空气的导热性较差，应进行热分布和热穿透试验以确认冷点达到预期灭菌效果。萎缩芽孢杆菌（Bacillus astrophaeus）通常被选作微生物挑战试验的生物指示剂。细菌内毒素灭活验证试验用于证明去热原工艺的效果。通常在待去热原物品中加入不少于1000单位的细菌内毒素，证明该工艺可将内毒素水平降低至少3个对数单位。细菌内毒素灭活验证试验中使用的细菌内毒素通常为大肠杆菌内毒素（E. coli endotoxin）。

灭菌设备内的空气应保持循环并维持正压。进入干热灭菌生产设备的空气应经高效空气过滤器（HEPA）过滤。HEPA过滤器应定期进行泄漏检测以确认其完整性。

辐射灭菌法

该方法是指利用电离辐射杀灭微生物。常用的辐射源包括⁶⁰Co或¹³⁷Cs衰变产生的γ射线、电子加速器产生的电子束以及X射线设备产生的X射线。能够耐受辐射的医疗器械、生产辅助用品、药品包装材料、原料药及成品均可采用此方法灭菌。

辐射灭菌工艺的开发必须考虑物品对电离辐射的耐受性及其生物负载等因素。为确保灭菌过程不影响物品的安全性、有效性和稳定性，必须确定最大可接受剂量。主要控制参数为辐射剂量（即物品的吸收剂量）。应建立灭菌剂量，确保灭菌后PNSU ≤ 10⁻⁶。辐射灭菌应采用最低可行辐射剂量。

辐射灭菌验证的关键在于剂量分布测试。在进行剂量分布测试前，应明确灭菌物品的包装形式、密度和装载方式。通过剂量分布测试，确定灭菌过程中的最大和最小剂量值及其所在位置。如日常监控使用参考测量点，还必须确定其剂量值与最大/最小剂量值之间的关系。辐射灭菌一般不使用生物指示剂进行微生物挑战试验。

在日常运行中，应进行生物负载监测和定期剂量审核，以确保持续的灭菌效果和剂量有效性。灭菌过程中，剂量计应监测灭菌物品所接受的辐射吸收量。剂量计的放置位置必须经过验证，以确认吸收剂量在规定限度内。剂量测量应可溯源至国家或国际标准。

气体灭菌法

该方法是指利用化学灭菌剂产生的气体来杀灭微生物。最常用的化学灭菌剂为环氧乙烷，通常与80%–90%的惰性气体混合，在充有灭菌气体的加压室内使用。采用气体灭菌时，必须注意灭菌气体的可燃性、爆炸性、致畸性和残留毒性。该方法适用于不耐高温或辐射的物品，如医疗器械、塑料制品和药品包装材料。干粉类产品不建议使用此方法灭菌。

采用此方法时，必须确认经解吸处理后残留的灭菌气体及其反应产物不会影响灭菌物品的安全性、有效性和稳定性。对于环氧乙烷灭菌，灭菌室温度、湿度、灭菌剂浓度和灭菌时间为影响灭菌效果的关键因素。

气体灭菌工艺的验证必须考虑包装材料和物品在灭菌室内的摆放方式对气体扩散和穿透的影响。萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）通常作为环氧乙烷气体灭菌的生物指示剂。

使用环氧乙烷灭菌时，必须进行泄漏测试以确认灭菌室的完整性。灭菌后，应采用经验证的解析程序来消除残留的环氧乙烷和其他挥发性残留物。必须对灭菌物品中的环氧乙烷残留量和反应产物进行监测，以证明符合规定的浓度限度并防止毒性风险。

过滤除菌法

该方法是指利用物理截留作用从气体或液体中去除微生物。通常用于气体和热不稳定溶液的灭菌。

在开发过滤除菌工艺时，应根据待过滤介质的性质和工艺目标选择适当的过滤器。对于除菌级过滤器，应选择膜孔径为0.22μm（或更小孔径或同等过滤效率）的滤膜。过滤器的孔径定义基于其微生物截留能力，而非平均孔径分布系数。选择滤材时，应充分评估其与待过滤介质的兼容性。过滤器不得通过与介质的反应、物质释放或吸附对产品质量产生不利影响。禁止纤维脱落，严禁使用含石棉的过滤器。为确保过滤除菌效果，可串联使用两个除菌级过滤器。在主过滤器前增设的除菌级过滤器作为冗余过滤器，两个过滤器之间必须保持无菌。

缺陷短波单胞菌（Brevundimonas diminuta）通常作为过滤除菌的挑战微生物。除菌级过滤器的截留试验要求在规定条件下，每平方厘米有效过滤面积能截留10⁷ cfu的缺陷短波单胞菌。但在某些情况下，若缺陷短波单胞菌不能代表最差工况，应使用生产中确定的最差工况菌进行截留试验。

每次过滤除菌操作结束后，应立即进行过滤器完整性测试——具体为泡点测试、扩散流/前进流测试或水侵入测试——以确认除菌过滤过程中滤膜的有效性和完整性。是否在过滤除菌前进行完整性测试由风险评估决定。灭菌前测试应考虑滤芯在灭菌过程中受损的风险；灭菌后测试需要采取确保下游无菌的措施。

在过滤除菌前，产品的生物负载必须控制在规定限度内。过滤器在使用前须经过灭菌处理（如在线或离线蒸汽灭菌、辐射灭菌）。在线蒸汽灭菌的设计和操作必须考虑滤芯所能承受的最大压差和温度。

与过滤除菌相关的设备、包装容器等物品应采用适当方法灭菌，并防止再次污染。

气相灭菌法

该方法利用分散在空气中的灭菌剂杀灭微生物。常用的灭菌剂包括过氧化氢（H₂O₂）和过氧乙酸（CH₃COOCH₃）。气相灭菌适用于密闭空间内表面的灭菌。

灭菌效果取决于灭菌剂剂量（通常为引入量）、相对湿度和温度。装载方式必须考虑密闭空间内物品的数量和摆放。微生物挑战试验用于确认灭菌效果；生物指示剂应放置在灭菌剂最难到达的位置。气相灭菌常用的生物指示剂包括嗜热脂肪地芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌和生孢梭菌（Clostridium sporogenes）。

在日常使用中，物品在气相灭菌前应经过清洗。灭菌过程中，应最大限度地暴露表面以确保灭菌效果。灭菌后，必须彻底清除或灭活残留的灭菌剂。

液相灭菌法

该方法将物品完全浸没于灭菌剂中，以杀灭表面微生物。经证实有效的灭菌剂包括：甲醛、过氧乙酸、氢氧化钠、过氧化氢、次氯酸钠等。

灭菌剂的选择必须考虑待灭菌物品的耐受性。影响灭菌效果的关键因素包括灭菌剂浓度、温度、pH值、生物负载、灭菌时间及物品表面的污染物。

在灭菌工艺验证过程中，应考虑最大总表面积的装载构型，确保灭菌剂能够接触所有表面，包括具有窄孔径物品的内表面。微生物挑战试验中常用的生物指示剂为萎缩芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。灭菌剂浓度和灭菌时间等灭菌参数应通过重复试验加以验证。灭菌后应彻底清除或灭活残留的灭菌剂。

在残留灭菌剂去除阶段，应采取措施防止灭菌物品被再次污染。在整个灭菌剂使用过程中应采取适当的安全防护措施。

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